蛋白质含量测定方法: 1.凯氏氮测量法:时间长,成本高,精度低,经典方法,但对假、毒奶粉无测量意义。 2.仪器测量法:速度快,成本低,精度高,改进方法,但多数要求蛋白质要纯。 补充: 1物理化学法 物理化学法是根据化学变化或与化学变化有关的物理变化前后某一物理量的变化测定待测物的方法. 1.1比色法 1.1.1双缩脉法:目前已有许多文章报道了双缩脉反应测定尿蛋白〔‘〕.双缩脉法优点是对白、红蛋白产生颜色反应相近,干扰物质少,不受温度影响.但灵敏度低,且操作复杂,很难用于自动化仪器分析. 1.1.2 Lowery法:结合双缩脉法中铜盐反应与Folin一Ciocalteau试剂反应的特点,通过芳香族氨基酸残基Tyr和Try的迅速反应与肤链、极性侧链或两者的铜络合物较慢的反应而把磷钥酸发色基团还原成暗蓝色,在波长750 nm处测定人监(zl.本法比吸光光度法(a=280 nm)的灵敏度大10 =20倍.比双缩脉法大100倍.但该法基于酸试剂与蛋白的反应是非特效反应,抗干扰的能力差. 1.1.3丹宁酸法:丹宁酸用来沉淀蛋白质,但沉淀结构散,可用Caiilne取代蛋白质,蛋白质游离出来后用免疫法或空氮法测定.但此法操作麻烦,加三氯化铁与丹宁酸蛋白质反应显色,5 min后于510 nm处比色,0.1 mol的丹宁酸可结合0.333 }cg白蛋白,灵敏度达5 mol/L,线性范围为0.05一1.8岁L. 1.2浊度法 利用沉淀与蛋白质反应产生的浊度与标准溶液浊度比较而定量测得蛋白质浓度的方法.磺基水杨酸和三氯化铁是常用的蛋白质沉淀剂,磺基水杨酸法灵敏度与精密度都较高,但干扰物质多,这两种浓度法都受温度的影响.但由于操作简单、快速、试剂易购,因此,虽然它们的准确度和精密度相对较差,目前仍为临床常规检查所用. 1.3染料结合法 这是一种用蛋白质与染料反应显色而测定蛋白质的方法.对测定痕量蛋白质,此方法很合适. 1.3.1紫外一可见吸光光度法:过去曾有用胶金[[31澳酚蓝[[41测定蛋白质的文章报道.近年来的报道多用丽春红或考马斯亮蓝( CBB) G - 250.考马斯亮蓝G - 250在酸性溶液中显红绿色,与蛋白质结合后变蓝色,AI仙x从465 nm移至595 nm.线性范围。^-100 mg/L.该法是1996年由Bradlford提出的〔5].另外,湖北大学宋功武[[6]等利用荧光素与牛血清蛋白(BSA)相互作用形成复合物,最大吸收峰波长为480 nm,比试剂本身红移9 nm,提出了分析方法,其线性范围Ow 100 mg/L,灵敏度为0.48 pg/cm2.北京大学李克安[n]等在pH3.1时,在硝基磺酚S中加入BSA,发现最大吸收波长由580 nm红移至685 nm,且硝基磺酚S的吸收峰随BSA的加入而下降,从而建立了测定蛋白质的一种方法.他们还测定牛血清白蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA),y-球蛋白(y-G) ,卵白蛋白(OVA)、血红蛋白(Hb)以及溶菌酶( Lys)的工作曲线.北京大学李娜等[fsl在pFi2 . 0条件下用偶氮肿( I})作显色剂测定了牛血清白蛋白,标准工作曲线线性范围为。^- 60 mg/ L,灵敏度为0.巧ug/cm2.她们还研究了酸度、离子强度等对偶氮肿( I})一BSA分子复合物形成的影响 1.3.2荧光法:这是近年来兴起的一种新的测定蛋白质的方法,现已报道的有白蛋白蓝670法等[9]‘其灵敏度一般较低.有报道利用5,10,15,20一四(( 4-磺苯基)叶盼(TPPS)的性质测定蛋白质的线性范围为0.1--9.0 mg/mL,检出限为0.05 mg/mL. 另外还有兰州大学覃文武等〔‘”〕发现在pH3.84--4. 51的HAc一NaAc缓冲溶液中加入BSA后,茜素红在470 nm处的激发峰荧光强度熄灭明显,且熄灭程度Fol F与加入的BSA浓度呈线性关系,从而建立了一种荧光摔灭法测定蛋白质的方法.其线性方程Fo/ F二0.9+0.12C (mg/L)‘西北大学魏永锋等【111发现在TritonX-100的磷酸缓冲溶液中辣根过氧化物酶( HRP )催化过氧化氢氧化邻苯二胺的产物2, 3一二氨基吩嚓的荧光强度有明显增强,在一定的实验条件下,该产物的荧光强度与HRP的含量成正比.从而建立了一种催化荧光光度法测定自RP的一种方法.线性范围10 -- 200 Pg.检出限为8 Pg.应用此测定体系并结合酶联免疫吸附(ELISA)方法,又测定了人血清中的甲胎蛋白.厦门大学李东辉等【lzl根据在pH3.0时四磺基铝酞著(A1S4Pc)浓度在5 X IO-}-2 x 10-6 mol/L范围内,BSA对AlS4Pc的荧光碎灭有显著作用,建立了以A1S4Pc为探针的荧光碎灭法测定白蛋白的新方法,线性范围0.10--4.50 mg/L.检出限为40 }cg/L. 1.4金属离子一染料结合法 借用金属离子一染料和蛋白质在适宜条件下反应进而检测蛋白的方法,发展很快.钦-4, 5一二澳基荧光酮(DBPF)一Tween-80与蛋白质的显色反应用来测得尿蛋白.在pH2.9,血清蛋白能与钦-DBPF-Tween-80形成蓝色络合物,a,} = 605 nm,加入少量乙醇能提高方法的灵敏度及稳定性,血清蛋白含量在。--6 mg/ml范围内服从比耳定律〔13].用邻苯二酚紫一钥与蛋白质在弱酸性介质中形成络合物,在波长h,a,} = 680 nm处可测定约30 pg/mL的白蛋白.其灵敏度和重现性优于考马斯亮蓝法及联苯三酚红一钥(VI)法,也有科学家提出了蛋白质的咪哇一锌盐体系〔14] 1.5电化学方法 根据被测蛋白质的浓度与其发生电化学反应时引起的某些物理量的变化成线性关系对蛋白质测定的方法. 1971年Kuwana}lsl首次在染料修饰的石墨电极上得到血红蛋白的电催化反应,为研究蛋白质大分子在电极表面的电子 传递反应作了开创性工作,也提供了有效的研究途径.目前已有大量对蛋白质进行电化学研究的报道. 郑州大学林琳等〔16〕对血红蛋白(Hb)在四甲基氯化按促进下于裸银电极上的直接电化学行为进行研究,在pH5 . 0的0.3mol/L HAc-NaAc缓冲溶液中于+0.4V一一o.lv范围内循环扫描,血红蛋白产生一对氧化一还原峰,当有四甲基氛化钱存在时,峰电位之差为0.14V(扫描速率为10 my/s).动力学研究表明:该反应为单电子转移,转移系数a为0.60,电极反应速率常数K,为0.103 S-I.重要的是,氧化峰电流与血红蛋白浓度在2 X 10-} -1.5 x 10-5 mol/L范围内有良好的线性关系.青岛化 工学院焦奎等[ml发现了一种将邻氨基酚(OAP)一过氧化氢一辣根过氧化物酶( HRP)伏安酶联免疫分析法测定人血清甲胎蛋白的方法.该方法是将HRP催化过氧化氢氧化邻氨基酚的酶催化反应与邻氨基酚的氧化产物在滴汞电极上的还原反应相偶合,在B-R缓冲溶液中,在一0.43 V( Vs. SCE)左右产生极谱波,根据测定标记在甲胎蛋白抗体上HRP的量,求得发生免疫反应的a-FP的含量,该方法对甲胎蛋白测定的线性范围为1.25一400 mg/L.另外北京大学朱志伟和李南强等【’“]研究了9,10-葱酿与血红蛋白的作用,结果表明:9,10-葱酿与血红蛋白作用可形成一种具有电活性的超分子化合物.并制备了化学修饰玻璃碳电极.可用于血红蛋白的检测.蛋白质的测定方法特别是物理化学方法还有不少,如丁永生等[19]利用血清中铁传递蛋白计量化学结合铁的性质,用标准铁饱和铁传递蛋白,通过对铁标准溶液准确定量测定血清铁传递蛋白的浓度.理想的方法是灵敏度高,线性范围广、干扰物质少、操作简单、快速、适应于常规临床检验、测尿或血液中各种蛋白成分的方法,但很难发现. 2免疫法 所谓抗原是指引起机体产生抗体的物质,而抗体是指在抗原的刺激下产生的物质.抗原与抗体结合生成沉淀以达到机体 免疫的目的.抗原和抗体都属于蛋白质,固定一定的抗体,通过免疫反应,就可测定蛋白质. 2.1免疫扩散法 1897年Kraus发现斑疹伤寒病原体的无细胞培养物和相应抗体混合时发生沉淀,第一次提出了免疫沉淀反应的报告 1905年Bechhold发现免疫沉淀反应可以在明胶中进行.1927年Beiuer发现明胶可以被琼脂代替,杭原与抗体的免疫沉淀反应 可以在琼脂中进行,琼脂是一种良好的惰性载体.1946年Oudin报道了在试管中进行免疫扩散技术.1948年Elek和Ouchter-long分别建立了同时比较鉴定两个以上抗体或抗原的技术,使免疫化学分析向前推进了一大步. 2.1.1环状免疫单扩散法:将一定量的抗体与含缓冲溶液的琼脂糖凝胶混匀铺成适当厚度的凝胶板,再把抗原滴进凝胶板的小孔中,在合适的浓度和湿度环境中,经过一定的时间,抗原由小孔向四周扩散,与沉匀在琼脂凝胶中的抗体相互作用,当杭体扩散到一定的距离,并且抗原抗体的比例合适时形成沉淀环,这一沉淀环是一种抗原抗体复合物.抗体的浓度一定,抗体向琼脂凝胶扩散形成的沉淀环不再增大,这时沉淀环的面积与抗原浓度在一定范围内呈线性关系,这样即可定量测定抗原物质一待测样品中蛋白质的含量。有人用此法测定了牛奶中的蛋白质〔2o] 2.1.2双向扩散法:一定浓度的琼脂糖凝胶是多孔的网状结构,大分子物质可自由通过,这种分子扩散作用可使分别在两处的抗原和相应抗体相遇形成抗原抗体复合物,比例合适时出现沉淀,沉淀的性质与位置取决于抗原分子量的大小、分子结构、扩散系数和浓度.如果抗体存在于多种有机大分子中,出现多条沉淀线,即可定性抗原、诊断疾病[f za]此法操作简单,且灵敏度高,是最常用的免疫法. 2.2琼脂糖免疫电泳法 免疫化学与琼脂电泳相结合形成了免疫电泳技术,这是一种灵敏度高的蛋白质分离鉴定技术.可用于定性、定量抗原或抗体.此技术是1953年由Graba及Wililims提出,后来由Scheigge:改进形成的一种微量蛋白质的测定.该法用样少、分辨率 高.可分为以下几种常用免疫电泳法: 2.2.1微量免疫电泳法:在有离子的琼脂糖的玻璃中心各挖一长槽,槽的两侧各挖一个小圆孔,孔内加入待测样品.电泳时,由于样品中各蛋白质的等电点不同,其带电性不同,因而被分离成几个区带.电泳后在长槽中加入相应的抗血清于37℃时扩散,分离的蛋白质就与相应的抗体形成大小不同、深浅各异的沉淀弧一般情况下每一沉淀弧代表蛋白质混合物中一种成分,以此进行定性、定量测定2.2.2对流免疫电泳:将抗原和抗体分别加入琼脂板样品孔内同时进行电泳.抗原由阴极向阳极移动,抗体向阴极倒退,两成分相遇,特效抗原与抗体结合,形成可见的白色沉淀物,即对流免疫电泳.这种方法是抗原与抗体在电场作用下定向移动,限制了抗原与抗体的自由式扩散,可提高灵敏度16倍. 2.2.3火箭电泳法:取一定量单价血清,与一定量琼脂凝胶混匀,然后铺板,板上挖几个小孔,每孔中加不同浓度的相应抗原,将此板放在pH8.6的电泳槽中进行电泳,在电场作用下抗原向正极泳动,在泳动中与凝胶中的抗体反应,逐渐形成类似火箭的沉淀峰.其峰的高度与抗原的浓度成正比,以此可定量抗原.国外有人用此法测定了全血清中的C一活性蛋白质〔23].如果被测抗原等电点与单价血清(抗体)的等电点相同,不仅需要用琼脂糖,而且需对抗原进行化学处理,使负电荷相对增加,这样处理后才能出现火箭峰.处理时,一般用氰酸钾或甲醛. 2.2.4双向定量免疫电泳法:双向定量免疫电泳法又称交叉电泳.先将抗原进行电泳分离蛋白质的各组分;放在抗体琼脂板上,使各组分在垂直方向再电泳一次,根据各组分和沉淀峰便可定性、定量抗原. 2.2.5放射免疫电泳法:RIA法是将放射性同位素测定法和免疫反应相互结合的一种技术.优点是特效、敏感、精确、简单一般不需要复杂的提纯步骤.目前该法已用于细菌和病毒抗原的分析、抗体的测定,各种免疫球蛋白和血清蛋白的定量测定及肿瘤有关的抗原测定等 2.3毛细管电泳免疫法 在用琼脂糖免疫法定量分析抗原和抗体蛋白质时,抗原和抗体的纯化是非常麻烦的间题.近年来发展较快的是毛细管免疫电泳,它的分离速度快、分辨率高且不受染色时间、温度、染色剂浓度、显色时间等因素影响.诸多优点使其广泛地应用于包括球蛋白在内的各种临床指标的检测.其基本原理是在进行毛细管电泳分离后将血清与某种蛋白的抗体混合后,观察峰高的降低,以此进行抗体的定性和定量测定.现在多采用计算机图像处理的方法,从电泳图谱中抽取有用的信息,采用图像分析技术确定电泳图谱中蛋白质的强度〔2s]. Klein及Joilifffz5]认为可用前清蛋白作为血清蛋白的毛细管电泳的检测限,用CE方法检测出血清蛋白等诸多蛋白质fz}] (待续) 3展望 现在报道的文章大多集中于纯蛋白或蛋白的简单复合物的测定,随着毛细管电泳等分离手段的快速发展,一次快速大量分离、测定一种样品中各种蛋白质的方法必将大量涌现.
较新的方法是: 1.
2.复2
3.
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